细胞增殖与凋亡相关因子在大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究

作者:代写论文来源：星论文网发布时间：2009-10-10 09:09:45

前言
原发性脬癌(以下简称肝癌)是起源于肝脏上度的恶性肿瘤。我国为肝癌高
发国家，每年有11万人死于肝癌，约占全世界肝癌死亡数的45％⋯。自1994
年以来，肝癌已经成为我国部分农村的首位癌症，在部分城市中仅次于肺癌而屠
第二位“’。该病流行广、病程短、进展快、病死率高、预后极差。据美国1995
年的统计，肝癌的相对5年生存率60年代为2％，70年代为3％一4％，80年代
亦仅为4％一7％“1。
上世纪80年代末·肝癌的预后有了明显改善，主要原因是利用血清甲胎蛋
白(alpha fctoprotein，AFP)在肝癌高发区进行普查以及超声影像诊断技术的不断
发展使小肝癌(small hepatocellular carcinoma，sHcC)的发现率提高，使患者赢
得了宝贵的早期手术时机，小轩癌也因此受到了人们的关注。
最早提出“小肝癌”这～概念的足日本学者okuda⋯，他在1977年报道了
20例直径小于5cm的小肝癌。1979年，我国汤钊猷等“报道了30例小肝癌的
诊断、治疗和预后。自此t小肝癌一词便常见于我国的医学文献，威了早期肝癌
的代名词。
何谓小肝癌?小肝癌也称亚临床肝癌，是指患者无临床症状，健康状况良好，
多是由于血清AFP普查或健康查体的影像学所发现的直径≤3cm的肝细胞癌，是
肝癌的早期病变⋯。上海医科大学肝癌研究所比较了589例小肝癌和1387例中
晚期肝癌，发现小肝癌的局部切除率高(93．2％对49 9％)，手术死亡率低(1-3
％对4．0％)，术后5年生存率显著提高(60．O％对22．2％)“1。该所还对144例
手术切除的小肝癌患者进行追踪，发现其l、3、5、10年生存率分别为91．8％、
76．3％、63．2％和45．7％”，提示小肝癌患者的预后明显优于大肝癌患者。
小肝癌反映了肿瘤的早期状况，是肝癌得以早期诊断、早期治疗、争取良好
细胞增殖与凋亡相关因子在人、小肝癌中的表达技其与预后关系的研究
预后的突破口。对小肝癌的研究得到了学术界的广泛重视，其诊断标准也各家不
一，直径≤5cm、4．5cm及3cm均曾被作为小肝癌的诊断标准。丛文铭和吴孟超“1
对比了直径≤3cm的小肝癌和大肝癌，发现66．7％的小肝癌癌细胞为二倍体，包
膜侵犯较少(16％)，癌栓形成较少(20％)，手术切除后5年生存率较高(75
％)；而大肝癌的癌细胞中则异倍体占92_3％，84％有包膜侵犯，80％有癌栓形
成，术后5年生存率仅为46．2％。该研究还表明，人体肝癌在瘤体直径近3cm
时，肿瘤细胞的DNA倍体开始从二倍体向异倍体发生转变，其生物学行为也从
早期相对良性状态向演进期明显恶性状态发生转变。可见，肝癌在直径3cm时
是其生物学特性发生明显改变的重要界限，将瘤体直径≤3cm作为小肝癌的诊断
标准更具科学性和客观性。目前，随着肝癌诊断水平的提高和对小肝癌病理特点
研究的深入，直径≤3cm作为小肝癌的诊断标准己得到广泛的认同。
从先前的众多研究我们得知：小肝癌的预后明显好于大肝癌的主要原因是小
肝癌的包膜浸润率、癌栓形成率及远处转移率均明显低于大肝癌，因而术后复发
率降低，5年生存率显著提高“”。这些研究仅仅从形态、生化及免疫等方面对肝
癌的一般性状和临床病理特征进行了大量的工作，但很少涉及分子机制。从分子
水平研究肝癌的发生、发展、浸润、转移的机制，寻找预测肝癌预后的指标及基
因治疗的靶点，已成为今后肝癌基础与临床研究的重点。
癌细胞的增殖能力是其发生浸润、转移的细胞学基础。长期以来，肿瘤被认
为是细胞增生失控的结果，因此人们不断探索这种生长失控的原因，寻找治疗的
办法，但未能取得满意结果。近年来，人们逐渐认识到，肿瘤发生不能单以细胞
生长失控来解释，它还可以由生长抑制的丧失、细胞凋亡的异常引起。正常情况
下，机体维持合适的细胞数量是通过增殖和凋亡的平衡实现的。机体通过凋亡机
制清除体内受损伤而不予修复的细胞，也可清除有癌前病变、基因发生改变的细
胞。当细胞增殖与凋亡的平衡失调时，上述细胞不能被完全清除，导致细胞克隆
的不协调增殖，从而发生肿瘤。可见，细胞增殖与凋亡的失衡在肿瘤转化中的作
用不容忽视。
细胞凋亡，也称程序性细胞死亡(pmgrammed cell deam，PcD)，是细胞在
定生理和病理条件下，由基因调控的主动而有序的自我消亡过程。作为维持机
体自身稳定的重要负调节机制，细胞凋亡不仅参与了胚胎发生、组织塑型、造血
2
细胞增殖与凋亡相关因子在大、小肝癌中的表达及茸与预后关系的研究
调控、发育、衰老等生理过程，而且与肿瘤等许多疾病的发生密切相关。细胞凋
亡过程存在复杂的调控网络，通常可分为三个阶段“1”1：
一．信号传递阶段：、
诱导凋亡的细胞外因素(环境因素和体内因素)经信号传递阶段以死亡受体
途径、应激途径或TGF．B途径进入细胞内，其中，死亡受体途径是介导凋亡的
最主要途径。Fas又称APO分子，cD95，属于TNF小GF受体超家族成员。Fas
与Fas配基(FasL)或Fas抗体交联后向胞内传导死亡信号，诱导细胞凋亡。细
胞毒性T细胞(cTL)表面存在天然的FasL，表达Fas的细胞也可通过FasL与
CTL结合而导致凋亡，因此也可称Fas，FasL是一种免疫防御系统。Fas，FasL系
统是激发肝细胞凋亡的主要介导途径，其在肝癌细胞凋亡中的作用备受关注，现
已证实肝癌组织中有Fas及FasL的异常表达。
二．中央调控阶段：
当凋亡信号传递到细胞内，细胞是否发生凋亡就出促凋亡因子和抑凋亡因子
之间的平衡来决定，Bcl—2家族成员在其中扮演重要角色。该家族的特点是成员
之问可通过BH结构域形成同源或异源二聚体，其含量丰富，检测凋亡信号的敏
感性强。Bcl—2和Bax是其家族中主要的抑凋亡与促凋亡成员。接受凋亡刺激后，
Ba】【从胞浆移至线粒体，引起线粒体通透性改变，使细胞色素c释放入胞浆中，
caspase活化、Pf蛆心裂解、DNA断裂，最终导致细胞凋亡。Bcl一2能在线粒体}二
形成离子通道，防止细胞色素c的释放和凋亡的发生。
二凋亡执行阶段：
当作出凋亡的决定后，细胞就进入了凋亡执行阶段，此时细胞表现出凋亡的
形态学特点，包括胞膜出现小泡、细胞皱缩、染色质浓集及其它生物学改变。
caspase家族是凋亡的关键执行者。迄今已在哺乳动物中发现14个caspase分子，
功能各不相同。一部分是对前凋亡信号作出反应的启动者，包括caspase2、8、9、
10等；另一部分则作为凋亡的效应者，直接水解与细胞解体相关的结构与功能
蛋白，包括caspase3、6、7等。新近发现的survivin是凋亡抑制蛋白(inhibition
apoptosis protein，IAP)家族的最小成员，主要通过直接抑制caspase3和7的活性
而发挥抗凋亡作用，是迄今为止发现的作用最强的凋亡抑制凶子。
以下用一简图示意细胞凋亡的调控过程：
细胞增殖与凋r相关因了在大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
细胞凋亡过程示意图
总之，细胞凋亡过程存在复杂的网络调控，多种凋亡相关因子及机制参与其
中并相互影响。
众多研究表明：小肝癌无论在DNA异倍体率、包膜侵犯率、癌栓形成率、
肿瘤转移率、术后复发率及生存率等方面均与大肝癌有显著差异。造成这种差异
的原因，除由于小肝癌尚处于临床早期外，其肿瘤细胞在分化程度、增殖及凋亡
等方面是否也与大肝癌有所不同呢?影响肝癌生物学行为及预后的相关因子有
哪些?本研究拟运用免疫组织化学及半定量RT—PcR技术检测Ⅺ67、Fas、Bcl一2、
Bax蛋白及survivin蛋白和mRNA在人体大、小肝癌组织中的表达，旨在通过比
较大、小肝癌的肿瘤细胞在I!=述各方面能力的差异，寻找影响肝癌生物学行为及
预后的相关因素，并探讨其可能的分子机制，国内外尚未见类似报道。
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细胞增殖与凋亡相关因子在大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
材料和方法
1．材料：
筛选1997～2002年本教研室存档的肝癌手术切除标本83例。其中大肝
癌43例，小肝癌(单肿瘤结节，瘤体直径≤3cm)40例。患者术前均未接受
经导管动脉栓塞(TAE)、超声导引瘤内无水乙醇注射(PEI)等非手术治疗。
有完整的临床血清学、影像学检查结果及术后随访资料。
2．方法：
2．1复习病历，收集一般性临床及病理资料，包括患者的性别、年龄、血清AFP
水平、有无肝炎及肝硬化病史、肿瘤大小、包膜完整与否、有无癌栓形成、
有无转移及复发等。其中，判断癌栓形成与否采用结合外科手术肉眼所见及
显微镜下观察的方法；通过电话随访了解患者的术后生存状况。
2．2标本处理：
所有标本均经10％的中性福尔马林液中固定，石蜡包埋，5p m连续切片，
常规HE染色。另外切片备用免疫组化研究。所有HE切片均在光镜下观察，
并按Edmondson四级法进行分级。该分级标准的主要依据包括：癌细胞胞浆
嗜酸性着色程度、胞核大小、核浆比例、核着色深度、细胞功能及组织结构
等。具体标准如下：
I级：癌细胞形态与正常肝细胞相似，胞浆明显嗜酸性，可见胆汁小滴；
核圆而规则，核浆比例接近正常，核仁明显，核分裂像少；细胞排列成梁索
状，梁索间血窦明显，衬以单层内皮细胞。
II级：癌细胞略显异型，胞浆中颗粒明显，略嗜碱性，内有较多胆汁小
滴：核较大，核浆比例接近或略大，核着色深浅不一，核仁明显；细胞多见
腺泡状排列。
III级：癌细胞异型明显，胞浆嗜碱性，胆汁小滴少见；核大而不规则，
核浆比例明显增大，出现瘤巨细胞，核染色质粗，着色不一致，核仁多且明
显，核分裂像多；细胞排列较不规则，偶见索状排列。
Ⅳ级：癌细胞形态变异大，常见较多的梭形细胞，偶见胆汁或无胆汁颗
粒；核大，核浆比例明显增大，核着色不均匀，核仁不规则；细胞排列松散，
无一定结构，偶见血窦。
细胞增殖与凋亡相关因了n：大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
本实验中I、II级被界定为高分化肝癌，III、Ⅳ级被界定为低分化肝癌。
本组肝癌病例的组织学分型：
梁索型：癌细胞呈梁索状排列，其中细梁由1～3层细胞构成，粗梁由4
层以上细胞构成，最多可达20～30层细胞。梁索问血窦丰富，衬以单层内皮
细胞。
腺样型：粗梁中央部分癌细胞坏死或毛细胆管扩张，癌细胞围绕扩张的
毛细胆管形成腺样结构，其内可充盈胆汁。
实体型：痛细胞丰富，弥漫分布，部分癌细胞呈镶嵌鹅卵石样排列，几
乎不见血窦或间质结缔组织。
透明细胞型：肿瘤的2／3以上区域由胞浆透亮的透明细胞组成。
2．3免疫组织化学染色
2．3．1主要试剂
(1)抗体本实验所用一抗名称、预处理方法、阳性部位及来源见下表
免疫组化所用抗体一览表
免疫组化染色采用SP法。
(2)SP超敏试剂盒Cat．No：Kit一9720 福建迈新
(3)DAB显色液武汉博士德
(4)0．1M柠檬酸抗原修复液(pH=6．O)
NaaC6HsO，·2H：O 12．059
CsHs0，·Hz0 1．899
deionized water 5000ml
(5)O．OlM磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7．4)
NaHzPO一·12l{20 209
细胞增殖与凋亡相关用了订·大、小肝癌中的表达皮其与预后关系的研究
N村IPO{·2Hz0
KaCl
deionized water
2．3．2设备
微波炉
不锈钢高压锅
电热恒温水浴箱
2．3．3玻片处理
1．59
42．59
5000ml
NationalIEC一705
市售
HH．W21．Cr600
所有的玻片经浓硫酸浸泡过夜，流水洗净，烘干后，按如下步骤进行硅化：
APES硅化液／anhydrous alcohol(V／V=l：50) 3min
anhydrous alcoh01 3min
deionized water 3min
600c烤干，室温保存。
2．3．4免疫组化染色
(1)5um连续切片，600C烤干，低温保存；
(2)600C烤片30min，二甲苯脱蜡15Ⅲin×3，然后分别放入100％、95％及
80％的乙醇中各3min；
(3)蒸馏水中洗净后进行抗原修复：
1)柠檬酸盐修复液微波加热至沸腾后放入玻片，中低火维持lO分钟，
自然冷却至室温；
2)高压锅内放入适量柠檬酸盐修复液，加热至沸腾后放入玻片煮至喷
气，计时2min，冷却至室温；
(4)蒸馏水中洗净后，PBs漂洗3×5II】in；
(5)将玻片浸入3％过氧化氢溶液中，室温，30min；
(6)PBs漂洗3×5Ⅲin；
(7)每张玻片滴加约65u l非免疫性动物(羊)血清，室温静置10mjn；
(8)倾去血清，每张玻片滴加约65“l一抗，40C孵育过夜：
(9)PBs漂洗3×5min；
(10)每张玻片滴加约65 p 1生物素标记的二抗，370C水浴箱孵育20min；
7
细胞增殖与凋亡相关冈子在太、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
(11)PBs漂洗3×5min；
(12)每张玻片滴加约65 u 1链霉素抗生物素蛋白一过氧化氢酶溶液，37。e
水浴箱孵育20min；
(13)PBS漂洗3×5Ⅲin；
(14)每张玻片滴加约65 u l新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察显色，出
现棕黄色阳性信号后立即在自来水中中止反应；
(15)自来水冲洗，苏木素复染2～3min，无水乙醇脱水，中性树胶封片。
每次实验均以已知阳性组织作为阳性对照，以PBs代替一抗作为阴性
对照。
2．3．5结果判断
免疫组化阳性反应的分级采用综合阳性细胞染色强度和阳性细胞所占
百分比判断标准“”。具体方法为：每张切片随机选取5个高倍视野，尽量
避开边缘区。用微测量网格计数所有细胞数以及阳性细胞数，计算阳性细
胞所占百分比的平均值。按染色强度评分：无色为O分，淡黄色为1分，
棕黄色为2分，棕褐色为3分。按阳性细胞所占百分比评分：阴性为0分，
阳性细胞数≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，>75％
为4分。染色强度与阳性百分比的乘积>3分为免疫反应阳性。按乘积分数
分为4个等级：一(O，l，2)；+(3，4)；++(6，8)：+++(9，
12)。
Ki67表达阻Ki67指数(1abelling index，LI)来表示，计数及分级
方法为：每个标本低倍镜(×100)下观察并确定有代表性的阳性视野，选
择5个视野，在高倍镜(×400)下每个视野数200个肿瘤细胞，计算其阳
性细胞百分比即为Ki67指数。Ki67指数>10％者为Ki67高表达；Ki67指
数≤10％者则为Ki67低表达“”。
2．4半定量RT—PCR
2．4．1实验材料
收集中山大学附属第一医院大肝癌手术切除标本8例，肿瘤医院小肝
癌手术切除标本3例，于一800c冰箱保存。l l例标本均分别取癌与癌旁组织
配对实验。收集到8例大肝癌病例的部分临床病理资料。
细胞增殖与凋亡相关因子在大、小肝痛中的表达及其与预后关系的研究
2．4．2主要试剂
Triz01 Invitrogen
逆转录试剂盒深圳晶美
Taq酶试剂盒TaKaRa
100bp DNA Marker 博大泰克
PCR引物上海生丁
琼脂糖进口分装
无水乙醇、异丙醇、氯仿国产分析纯
TBE电泳缓冲液(10×TBE)：
1089Tris：559硼酸；40m1 0．5Ⅲol／l EDTA(pH=8．O)；加去离子水至
1000m1。使用时用去离子水稀释20倍成O．5×TBE工作液。
2．4．3设备
～800c冰箱R本三洋
台式高速低温离心机(Centri fuge 5403) Eppendorf
PCR仪(GeneAmp PCR system 9600) PE
紫外一可见分光光度仪(Ultrospec 2000) Pharmacia Biotech
电泳仪及电泳槽BIO—RAD
一次性凝胶摄像仪F1uor Chem“8900
图像摄录输入仪F1本JVc ky F30B 3 CCD
图像分析系统德国KO阿RON lBAS2．0
2．4．4组织总RNA的提取和鉴定
(1)取一800c冰箱保存的新鲜肝癌组织，加1m1 Triz01，冰卜匀浆至未见组
织颗粒；
(2)室温静置5min；
(3)加入O．2ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温静置15min至分层；
(4)12，000rpm离心15min，48C；
(5)将上层水相移入另一一离心管内，加入o．5ml异丙醇混匀，室温静簧
10min：
(6)12，000rpm离心15Ⅲin，40c，弃上清；
9
璺H胞增殖与凋产相关因子在大、小jj于癌中的表达发其与预后关系的研究
(7)加入1m175％乙醇洗涤沉淀；
(8)7，500rpm离心10min，40c，弃上清，}：燥6min；
(9)用DEPC水50u 1溶解沉淀；
(10)取2u 1总RNA用998H 1去离子水稀释，在紫外分光光度仪上测A260
及A280。
2．4．5 cDNA合成
按逆转录试剂盒说明书操作，步骤如下：
冰上0．5m1EP管中加入：
total RNA 5u l
oligo(dT)．8primer(O．5p g／u 1) l u l
力口DEPc水6u 1
轻柔混匀、离心后置70“c 5mjn，立即冰上冷却；
力Ⅱ入5×reaction buffer 4u 1
Ribonuclease inhibitor(20 u／u 1) 1 u 1
lOIllM dNTP mix 2H 1
轻柔混匀、离心后置370c 5min，立即冰t冷却；
加入M—MLv逆转录酶(200u／u1) 1 pl至总体积20u1
420C 60min：
700C 10min，立即冰上冷却，一200c保存备用。
2．4．6 PCR
2．4．6．1引物序列
survivin：5’～CCA GAT GAC GAC CCC ATA GA一3’
5’一CCT CTG GTG CCA CTT TCA AG 3’
产物片段大小为40lbp；
GAPDH： 5’一TCC ATG ACA ACT TTG GTA TCG TG一3’
5’一TGC AGC GTA CTC CCC ACA T一3’
产物片段大小为208bp。
2．4．6．2反应体系
Taq酶体系试剂盒溶液25u l
10
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Drimerl(20u M) 1 u l
primer2(20 u M) 1 u l
template DNA 2 u l
去离子水21 u1
总体积50u l，轻柔混匀，滴入矿物油覆盖。
2．4．6．3反应条件
940C预变性5min
94。c lmin 、
58℃ 30sec ≯循环
720C 45sec J
720C延伸10min。
确定PCR反应到达平台期前的循环数：在模板量一致的情况下，丁15、
20、25、30、35、40个循环后各取出一管PcR产物，同时电泳，选择产物
灰度呈规律递增变化的相邻3个PcR循环数，中间一个定为反应循环数。
survivin的PcR循环数为30，GAPDH的PCR循环数为20。
PcR产物一200C冰箱保存备用。
2．4．7电泳及结果分析
产物于2％琼脂糖凝胶电泳，电压5v／cm，PCR产物上样量为10 u 1。
电泳完毕，EB染色，一次性凝胶成像仪摄片。将survivin与GAPD}I电泳条
带的平均光密度和面积乘积的相对比值作为survivin的表达量，半定量分
析survivin的表达水平。
3．数据的统计分析
用统计学软件SPSSll．O对实验结果所得的计量和计数资料进行多项分
析和比较。本实验计量资料用算术均数±标准差(x±sd)描述，两组样本
问均数比较采用独立样本T检验(并做方差齐性分析)；等级资料采用似
然比x 2检验；变量之间采用Pearson等级相关分析研究其相关性；对大、
小肝癌的预后差异及各变量与肝癌预后的关系进行Kaplan№ier生存分析
检验；采用Cox Regression分析影响肝癌预后的主要因素。
细胞增蒴与凋亡相关因了在大、小肝癌中的表达发其与预后关系的研究
实验结果
一般性临床病理资料结果：
本组病例共83例，其中男性74例，女性9例。患者年龄9～74岁，平均
年龄46．71岁。所有病例均经病理诊断证实为肝细胞癌。参照Edmondson分级
标准对83例肝癌病理切片进行组织学分级，其中高分化者66例，低分化者17
例(图1～4)。小肝癌的诊断标准为单肿瘤结节，瘤体直径≤3cm，共计小肝癌
40例，大肝癌43例。
所有病人均经肝癌手术切除治疗，无手术死亡。术后均经过随访，其中术
后生存期最长者为68个月，最短者为1个月，中位生存期28个月。大、小肝
癌患者的中位生存期分别为22和42个月。肿瘤的一般性临床病理资料详见表
l。
表1 大、小肝癌的一般性临床病理资料
临床病理指征小肝癌(40例) 大肝癌(43例)
HBsAg阳性
肝硬化
血清AFP<400ug／L
肿瘤高分化
肿瘤低分化
梁索型
实体型
腺体型
透明细胞型
包膜完整
癌栓形成
肿瘤转移
术后复发
术后生存<1年者
术后生存≥1年者
术后生存≥2年者
87．5％(35／40)
90．O％(36／40)
65．O％(26／40)
82．5％(33／40)
17．5％(7／40)
77．5％(31／40)
15．O％(6／40)
2．5％(1／40)
5．0％(2／40)
60．O％(24／40)
12．5％(5／40)
15．O％(6／40)
47．5％(19／40)
7．5％(3／40)
92．5％(37／40)
3
3
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3
3
3
3
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3
3
3
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隅
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兰兰
慨
慨
溉
阻
叭
盯
孤
组
鼹
乱
乱
良
M
弧
托
孤
则
眠
弛
细胞增殖与凋亡相关因子在大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
2．各临床病理指征在大、小肝癌中的差异分析：
对各临床病理指征在大、小肝癌中的差异进行似然比x 2检验。统计结果
显示：肝硬化病史、血清AFP水平、包膜侵犯情况、癌栓形成率及肿瘤转移率
在大、小肝癌中具有显著差异；而HBsAg阳性率、肿瘤分化程度在大、小肝癌
中的差异无统计学意义。具体结果见表20一
表2 临床病理指征在人，小肝癌中的差异
临床病理指征小肝癌大肝癌x
2 P
本组病例中35％(14／40)的小肝癌患者血清AFP水平>400u g／L，其中最
高为7500p g几；本组13例血清AFP水平>10000u g／L者均为大肝癌患者，其中
92，3％(12／13)的肿瘤包膜不完整或无包膜，38．5％(5／13)发生肿瘤转移，
61．5％(8／13)术后1年内复发，53．8％(7／13)术后生存期<1年。
在本组6例发生转移的小肝癌病例中，有50％(3／6)的肿瘤包膜不完整，
66．7％(4／6)有癌栓形成。其中，包膜侵犯和癌栓形成皆有的3例术后生存期
均<1年；在19例发生转移的大肝癌病例中，84．2％(16／19)有包膜不完整或
无包膜，78．9％(15／19)有癌栓形成。其中，63．2％(12／19)的患者术后生存
期<1年，78．9％(15／19)的患者术后生存期<2年。
细胞增殖与凋亡相关因子在人、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
3．各项免疫组化指标在大、小肝癌组织中的表达差异分析：
1)Ki67免疫组化阳性定位于肝癌细胞的胞核(图5～6)。I(i67蛋自在小肝癌组
织中的表达较大肝癌低，但独立样本T检验的结果表明，二者的差异不具有
统计学意义。具体结果见表3．1。
表3．1 I(i67在大、小肝癌组织中的表达
2)Fas免疫组化阳性定位于肝癌细胞及癌旁肝细胞的胞膜和(或)胞浆，其中，阳
性细胞多分布于癌巢边缘组织及癌旁组织的淋巴细胞浸润区(图7～8)；Bc卜2
阳性定位于肝癌细胞及癌旁肝细胞的胞膜、胞浆和(或)核膜(图9～10)；Bax
阳性定位于肝癌细胞及癌旁肝细胞的核周胞浆(图ll～12)；survivin在肝痛
细胞中的表达，或定位于胞核，或定位于胞浆，或胞核、胞浆均有表达，而
癌旁肝细胞中survivin的表达只定位于胞浆(图13～15)。
对Fas、Bcl—2、Bax及survivin蛋白在大、小肝癌组织中的表达差异进
行似然比x 2检验。统计结果显示：Fas与Ba)【在大、小肝癌中的表达具有显
著差异。具体结果见表3．2。
表3．2 Fas、Bcl．2、Bax及survivin蛋自在大、小肝癌组织中的表达
14
细胞增殖与捌广：辛目关因子在大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
免疫组化指标小肝癌大肝癌x
2 P
Bax ++ 22．5％(9姐O) 11．6％(5／43)
+++ 17．5％f7，40) 7．0％(3，43) 8，997 O．029
SUrVlVln +
++
+++
4J0．0％(16“O)
37．5％n5，4D)
17．5％(7“0)
5．O％(2，40)
32．6％(14，43)
39．5％(17，43)
16．2％(7，43)
11．7％(5／43) 1．478 O．687
4．各项免疫组化指标在肝癌及癌旁组织中的表达差异分析：
1)对Fas、Bcl一2、Bax及sunrivin蛋白在小肝癌及癌旁组织中的表达差异进行似
然比x 2检验。统计结果显示：Bcl—2、Ba)【及su『vivin在小肝癌及癌旁组织
中的表达具有显著差异，FaS在小肝癌及癌旁组织中的表达差异无统计学意
义。具体结果见表4．1。
表4．1 Fas、Bcl．2、Bax及survivin蛋白在小肝癌及癌旁组织中的表达
15
细胞增殖与凋亡相哭因子在大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
2)对Fas、Bcl一2、Bax及survivin蛋白在大肝癌及癌旁组织中的表达差异进行似
然比x 2检验。统计结果显示：Fas、Bcl．2及survivin在大肝癌及癌旁组织中
的表达具有显著差异，Ba】【在大肝癌及痛旁组织中的表达差异无统计学意义。
具体结果见表4．2。
表4．2 Fas、Bcl．2、B“及survivin蛋白在大肝癌及癌旁组织中的表达
本组结果中有6例小肝癌相应的癌旁组织有survivin的阳性表达，此6例
全部有肿瘤包膜浸润，其中癌栓形成率及肿瘤转移率均为33．3％(2／6)，术后复
细胞增殖与凋亡相关因子在人、小肝癌中的表返及其与预后关系的研究
发率为右6．7％(4／6)，33．3％(2／6)的患者术后生存期<1年；在癌旁组织有
survivin阳性表达的15例大肝癌病例中，有80％(12／15)的胂瘤包膜不完整或
无包膜，j3．3％(8／15)的病例有癌栓形成，66．7％(10／15)的病例发生转移，术
后复发率为86．7％(13／15)；53．3％(8／1j)的患者术后生存期<1年，66，7％
(10／1 5)的患者术后牛存期<2年。
5．免疫组化指标与肝癌分级、包膜侵犯、癌栓形成及肿瘤转移间关系的相关分析：
对免疫组化指标与肝癌分级、包膜侵犯、癌栓形成及肿瘤转移问的相关关系
进行Pearson相关分析。统计结果表明：Fas的表达与癌栓形成及肿瘤转移呈显
著负相关：Bax的表达与肿瘤转移呈显著负相关；survivin与Ki67的表达均与包
膜侵犯、癌栓形成及胂瘤转移呈显著正相关：Kj67的表达与肿瘤分级呈显著证
相关。具体结果见表5。
表5免疫组化指标与肝癌肿瘤分级、包膜侵犯、癌栓形成及肿瘤转移问的相关分析
塑些塑堕兰塑主塑茎旦王堡查：!：墅堡!堕墨丝墨基皇望亘茎至塑生塑
2 corrclation js s远nificant at the．05】eveI(2一tailed)
44 corrclation is significant at山e．01 leVel(2一tailed)
6．各免疫组化指标间的相关性分析：
对各免疫组化指标间的相关性进行Pearson相关分析。统计结果显示：Fas
的表达与sur、，ivin、Ki67之间均呈显著负相关；sur、，ivin与I(i67的表达呈显著
『F相关；Bcl一2与Ba)【的表达呈显著负相关。具体结果见表6。
表6 各免疫组化指标之闯的相关分折
+ correl撕on is significant at t11e．05 1evel(2一tailed)
44 correlation is signmcarIt at tlle．Ollevel(2一tailcd)
7．大、小肝癌的预后差异及影响肝癌预后的相关因素的分析：
7．1大、小肝癌术后复发率及生存率的差异分析：
1)对大、小肝癌术后复发差异进行Kaplan—Meier生存分析。统计结果显示
小肝癌患者的术后复发率显著低于大肝癌患者。如图7．1．1所示。
细胞增殖与凋亡相关因子在大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
*
N
排
酱
复发时间(月)
图7。1．1 大、小肝癌术后复发率差异
2)对大、小肝癌术后生存率差异进行K印l釉一Mei盯生存分析。统计结果显示：
小肝癌患者的术后生存率显著高于大肝癌患者。如图7．1．2所示。
怫
甜惜
生存时间(月)
圈7．1．2 大、小肝癌术后生存率差异
19
细胞增殖与凋亡相关因子在大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
7．2各免疫组化指标与肝癌预后的关系：
1)对Fas、Bd-2、Ba)【、survi谊l及站67蛋自与术后复发率的关系进行Kapl翘
一Meief生存分析。统计结果显示：suⅣivin及鼬67蛋白与肝癌术后复发密
切相关。如图7．2．1及7-22所示。
甜
对
湃
惜
复发时间(月)
图7．2．1 survivin表达与术后复发率的关系
Sta_tistic Signi=丘c柚ce
Log R姐k 28．18 O．000
统计结果显示：肝癌高表达suryivin者的术后复发率显著高于不<低)表达者。
册瓣娜
慑
复发时间(月)
图7．2．2 Ki67表达与术后复发率的关系
细胞增殖与凋亡相关因子在大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
统计结果显示：肝癌组织高表达Ki67者的术后复发率显著高于低表达者。
2)对F嬲、Bcl-2、Ba)【、suⅣiviⅡ及鼬67蛋白与术后生存率的关系进行Kapl锄一
Meief生存分析。统计结果显示：Fb、survivin及鼬67蛋白与肝癌术后生存
率密切相关。如图7．2．3、7．2．4及7．2．5所示。
特
蒋
生存时间(月)
图7．2．3 Fas表达与术后生存率的关系
统计结果显示：肝癌组织不(低)表达Fas者的术后生存率显著低于高表达者。
2l
细胞增殖与凋亡相关因子在大、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
生存时间(月)
图7．2．4 survivin表达与术后生存率的关系
统计结果显示：肝癌组织高表达survivin者的术后生存率显著低于
不(低)表达者。
生存时间(月)
图7．2．5 Ki67表达与术后生存率的关系
Log RaI盘
Stalistic Si班ficance
12．79 O．000
22
降甜懈
降甜惜
细胞增殖与凋亡相关因子在太、小肝癌中的表达及其与预后关系的研究
统计结果显示：肝癌组织高表达Ki67者的术后生存率显著低于低表达者。

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