肝细胞生长因子对子宫内膜癌细胞增殖影响的实验研究(1)

作者:代写论文来源：星论文网发布时间：2009-10-10 20:12:10

作者：都红蕾，孙奋勇，陈勍，潘秋辉

【摘要】 目的观察肝细胞生长因子（HGF）对子宫内膜癌细胞HEC2B增殖的影响及子宫内膜癌细胞HEC2B中HGF受体Cmet的表达，了解HGF对子宫内膜癌细胞的作用及其机制。方法体外培养人子宫内膜癌细胞HEC2B，用RTPCR的方法检测HEC2B中HGF受体Cmet有表达。对HEC2B进行24 h血清饥饿后用不同剂量的HGF作用于HEC2B。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)分析细胞的增殖力,用流式细胞仪检测细胞的增殖周期。结果 Cmet在HEC2B细胞中稳定表达，HGF促进细胞的增殖,并在一定的范围内有剂量依赖关系，各处理组与对照组相比，P<0.05。当HGF浓度达到60 ng· mL-1时，增殖水平较对照上调约1.9倍。结论 HGF/Cmet能够在体外促进子宫内膜癌细胞的增殖。

【关键词】 子宫内膜癌细胞；肝细胞生长因子；肝细胞生长因子受体

　　Abstract:Objective To study the effects of hepatocyte growth factor on endometrial cancer cells, detect the alterations of cell proliferation and expression level of HGF receptor Cmet and understand the molecular mechanism. Methods Endometrial cancer cell line, HEC2B was cultured in vitro. The expression level of Cmet in HEC2B was determined with RTPCR. HEC2B was treated with HGF at different doses. Cell proliferation was analyzed with MTT assay. Cell cycle distribution was examined with FACS. Statistical evaluations were conducted using ttest. Results Cmet was expressed in HEC2B cells. Compared with controls, HGF could promoted the proliferation of HEC2B in a dosedependent manner (P<0.05). Treatment with 60 ng· mL-1 HGF increased the proliferation level by 1.9 fold. Conclusion Cmet was expressed stably in HEC2B cells. HGF/Cmet system promoted the formation, development and proliferation of endometrial cancer cells in vitro.

　　Key words:endometrial cancer cell; hepatocyte growth factor; hepatocyte growth factor receptor

　　子宫内膜癌是女性生殖道常见三大恶性肿瘤之一，近20年来在世界范围内子宫内膜癌发病率有上升趋势。肝细胞生长因子(HGF)是一个多功能生长因子。HGF的单一受体Cmet是一跨膜蛋白，由原癌基因Cmet编码。在许多恶性肿瘤中Cmet被过表达［1-6］。HGF/Cmet与子宫内膜癌的关系却鲜有报道。本研究通过观察子宫内膜癌细胞中Cmet的表达及HGF对子宫内膜癌细胞的作用，旨在为临床以HGF／Cmet为靶点治疗子宫内膜癌提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与细胞株

子宫内膜癌细胞株HEC2,购自中科院细胞库;RNase、胰蛋白酶、DMEM 培养基、Trizol、逆转录酶Superscript Ⅲ为Invitrogen公司产品;优质胎牛血清,Gibco公司;HGF购自R&D， Agarose 、G418 由Sigma公司提供。PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix购自ABI公司。EPICS AL TRA流式细胞仪,美国Beckman Coulter公司提供。

　　1.2 HEC2B细胞的体外培养与诱导

将细胞以1×105/cm2接种于细胞培养瓶中，每瓶加入5 mL含10%(φ)FBS（胎牛血清）的DMEM；培养24 h后，换5%FBS的DMEM饥饿培养12 h，分别加入浓度为20、40、60、80、100ng·mL-1的HGF进行处理，设置空白组不进行诱导，培养基中FBS的浓度改成5%；培养48 h后收集细胞。

　　1.3 PCR

　　用PBS清洗细胞，用Trizol法抽提RNA，并常规检测RNA的纯度及完整性。反转录，用人的βactin基因检测反转录是否成功。PCR条件为：94 ℃ 5 min 激活聚合酶，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃45 s，共33循环，72 ℃保温10 min，4 ℃保温10 min。采用琼脂糖凝胶检测的方法进一步验证。Realtime定量PCR条件为：95 ℃ 5 min 激活聚合酶，95 ℃变性15 s，57 ℃退火5 s，72 ℃ 25 s，共45循环。采用ABI7300系统进行检测，每个循环结束检测荧光强度。融解曲线分析:每分钟读1次，检测范围为55 ℃ 到 95 ℃。荧光强度检测采用动态跟踪的方法，自动测出Ct值（每个反应管内的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数），用2△△Ct 表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，并采用琼脂糖凝胶检测的方法进一步验证。Βactin引物序列如下：上游引物 5′gctct tttcc agcct tcctt3′,下游引物 5′ tgatc cacat ctgct ggaag3′。Cmet检测引物序列：上游引物5′ttcaagtagc caaagcgatg3′,下游引物 5′gtgtttacgtcaggataag3′ 。Cmet检测引物序列：上游引物5′ttcaagtagc caaagcgatg3′,下游引物 5′gtgtttacgtcaggataag3′,产物大小300 bp。

　　1.4 用MTT法检测细胞增殖能力

　　取对数生长期的细胞，用含0.25%(φ)胰酶消化，悬浮于适量培养基中，通过细胞计数将其浓度调整到4×104个细胞/mL。将此细胞悬液以100 μL/孔均匀接种到细胞培养板上，置于37 ℃，5％CO2的培养箱中，培养24 h后，换成稀释液，继续培养24 h，使细胞饥饿。分组加药，分别将含20、40、60、80、100 ng· mL-1HGF的培养液100 μL加入细胞培养孔中，每个稀释度做4个复孔，设立空白对照组。加样后置于37 ℃，5％CO2的培养箱中继续培养44 h，每孔加入20 μL MTT染色液，继续培养4 h；弃去培养液，加入抽提液150 μL/孔，置于微量振荡器张充分振匀以抽取染料，振动15 min。以570 nm为检测波长，630 nm为参考波长，用酶标仪测定各孔的吸光值（A）

　　1.5 流式细胞检测

消化并收集细胞，每检测管中(0.5～1)×106细胞，PBS清洗一遍，离心去上清，转速1 000 r/ min，5 min，沿管壁缓慢加入终浓度70％(φ)的乙醇，混匀，－20 ℃ 固定过夜，1 000 r/min 离心5 min去上清，PBS清洗一遍，加入Rnase抑制剂50 μL，加入50 μg/mL的PI染料混匀，4 ℃ 避光30 min，上机检测。

　　1.6 统计学方法

采用t检验，P<0.05 为差异有显著性。

　　2 结果

　　2．1 HEC2B的培养与传代

　　HEC2B为起源于子宫内膜癌的细胞系，在10% 胎牛血清( Fetal Calf Serum, FCS)，DMEM培养基，5％ CO2，37℃的培养条件下，细胞生长良好，其形态见图1所示。

将上述总RNA逆转录后，采用PCR的方法进行扩增，电泳后进行EB染色（图3），发现得到条带的大小与预计的300 bp相符合，表明在HEC2B细胞中具有Cmet基因的转录。

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