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蛋白酶高产菌株的选育

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作者:原作原创  来源:网络转载  发布时间:2018-03-14 09:54:00

  摘 要:用严谨的分离纯化方法对土壤中产蛋白酶的菌株进行筛选,再用紫外诱变的方法对土壤中的蛋白酶高产菌株进行筛选,最后对得到菌株进行形态、生理生化的鉴定。已知土壤中产蛋白酶的菌株会使含有蛋白质的培养基产生透明圈,透明圈直径与菌落直径的比值与菌株产蛋白酶量成正比。一般紫外诱变会使菌株发生正诱变。 
  关键词:蛋白酶;诱变;芽孢杆菌 
  中图分类号:S188 文献标识码:A DOI:10.11974/nyyjs.20180133003 
  引言 
  蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂,能催化蛋白质和多肽水解,广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性中都大量地使用蛋白酶。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶,既节省时间,又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清[1]。临床上可作药用,如用胃蛋白酶治疗消化不良,用酸性蛋白酶治疗支气管炎,用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。由于动植物资源有限,工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。因此,选育出蛋白酶高产菌株至关重要。本实验以树林土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株,采用紫外线照射诱变方法育种,筛选得到高产蛋白酶菌株。 
  1 材料与方法 
  1.1 培养基配置与灭菌 
  配置2瓶200mL1.8%琼脂培养基和2瓶250mL营养琼脂培养基。 
  取7只试管,每支試管加9mL水,加塞湿热灭菌。取10个平皿,用报纸包成1包,干热灭菌。取1个三角瓶,装入90mL水,加塞湿热灭菌。 
  1.2 菌株分离筛选 
  无菌制平板。融化培养基,加入牛奶40mL,倒平皿,每组6皿,贴好标签。 
  制备菌悬液。取土样10g倒入90mL水中,振荡,静置30s,上清液为菌悬液。 
  菌液10倍梯度稀释。1mL菌液加入9mL水中,混匀,吸取稀释的菌液再加入到新9mL水中,混匀;以此类推,制备10倍梯度稀释。 
  涂布法将菌接种于平板上和培养。分别取10-5、10-6、10-7的菌液各100μL,倒置于30℃培养箱恒温培养2d。 
  1.3 记录分离结果和菌株纯化 
  观察各平板的菌落周围情况,对有透明圈的菌落进行编号;测定透明圈直径和菌落直径,作好记录;计算透明圈直径(H)与菌落直径(C)的比值;选取H/C比值较大的4株菌分别进行下一步纯化。 
  菌落纯化。融化培养基,加入牛奶40mL,倒平皿,每组4皿,贴好标签(Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4);挑取H/C比值较大的菌落进行平板划线(分区划线法),倒置于30℃培养箱恒温培养。 
  1.4 培养基配置与灭菌 
  配置1瓶200mL1.8%琼脂培养基。 
  取12支试管,每支试管加9mL水,加塞湿热灭菌。取10个平皿,用报纸包成1包,干热灭菌。取1个三角瓶,装入250mL水,加塞湿热灭菌。 
  1.5 紫外诱变 
  1.5.1 制备菌悬液 
  取出纯化后的平皿,在平皿中加入蒸馏水2mL,用无菌涂布棒刮取菌苔,移液器取出菌液至无菌试管中,反复冲洗菌苔,一并转移至无菌试管中。直至体积达15mL,用移液器吸打混匀悬浮菌体,至单细胞悬液。 
  1.5.2 对照组的稀释涂布 
  吸取1mL菌液加入9mL水的试管中,进行10倍梯度稀释,作为对照(未经紫外照射),分别取10-6、、10-7的菌液各100μL,均匀涂布于牛奶平板上,倒置于30℃培养箱恒温培养。 
  1.5.3 紫外诱变 
  剩下的菌液14mL加入1无菌大头针,并置于磁力搅拌器上,搅拌混匀悬浮;打开紫外灯预热20min后,用15W紫外灯进行照射处理2min,打开皿盖计时(需在黑暗条件下操作)。 
  1.5.4 实验组的稀释涂布 
  取照射2min的菌液1mL,加入9mL水的试管中,进行10倍梯度稀释,分别取10-4、、10-5的菌液各100μL,均匀涂布于牛奶平板上,倒置于30℃培养箱恒温培养。 
  1.6 观察与记录诱变结果 
  观察测量对照处理的菌落透明圈,测定透明圈直径和菌落直径;计算透明圈直径(H)与菌落直径(C)的比值;分析结果原因,挑选菌落,在斜面划线。 
  1.7 细菌菌株鉴定 
  1.7.1 培养基制备 
  淀粉水解培养基:取1支三角瓶,配置100mL的营养琼脂粉和可溶性淀粉0.2g/L培养基;明胶液化培养基:配置50mL的营养肉汤和明胶(8g)培养基,溶化后分装到5支试管中,每支管6mL;半固体培养基:配置50mL半固体培养基,溶化后分装到5支试管中,每支管6mL;三糖铁培养基:配置50mL三糖铁培养基,溶化后分装到5支试管中,每只管8mL;乳糖发酵培养基:配置50mL乳糖发酵培养基,分装到5支试管中,每支管6mL,加入1个杜氏小管;mR:配置50mL mR培养基,分装到10支试管中,每支管5mL;vP:配置50mL mR培养基,分装到10支试管中,每支管5mL;柠檬酸盐培养基:配置50mL柠檬酸盐培养基,溶化后分装到5支试管中,每支管5mL。培养基121℃,15min湿热灭菌,取出后摆斜面;葡萄糖发酵培养基;蔗糖培养基;棉籽糖培养基;山梨醇培养基;纤维二糖培养基;水杨苷培养基;淀粉水解培养基。 
  1.7.2 进行菌株鉴定并观察与记录结果 
  半固体穿刺:穿刺接种,培养后观察有无鞭毛结构。 
  营养琼脂斜面:斜面划线,培养后进行革兰氏染色,镜检,观察菌落特点。 
  革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染4个步骤。 
  三糖铁:穿刺后斜面划线,培养后观察颜色。 
  柠檬酸盐:斜面划线,培养后观察颜色。 
  乳糖发酵:接种环划菌(液体接种法),培养后观察颜色。 
  明胶液化:接种环划菌(液体接种法),培养后观察颜色。 
  MR:接种环划菌(液体接种法),培养后,加2滴甲基红,观察颜色。 
  VP:接种环划菌(液体接种法),培养后,加2滴甲液后加2滴乙液,观察颜色。 
  葡萄糖发酵,蔗糖培养基,棉籽糖培养基,山梨醇培养基,纤维二糖培养基,水杨苷培养基,淀粉水解培养基:液体接种法,培养后观察颜色。 
  2 结果与分析 
  2.1 细菌菌株鉴定结果与分析 
  3 结论 
  紫外诱变后的产蛋白酶含量不高。本实验最后紫外诱变得到革兰氏阴性菌、短杆菌、无芽孢。为此本组成员对存在问题讨论,由于实验课程有限,本实验组成员对原因进行了猜测:在测量菌落透明圈直径和菌落直径时存在误差;紫外诱变的过程中出现操作性问题。 
  现今,蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。因此,选育出蛋白酶高产菌株至关重要,本实验组将继续研究蛋白酶高产菌株的选育问题,争取最后得到目的菌株—蛋白酶高产的芽孢杆菌。 
  参考文献 
  [1]徐建国,田呈瑞,胡青平,罗季阳.高产蛋白酶菌株的筛选及产酶条件优化[J].中国粮油学报,2010,10(25):10. 
  [2]王婧,王晓丹,罗晓叶,邱树毅,肖蓓,张小龙,胡鹏刚.酱香大曲中高产蛋白酶功能细菌的筛选及鉴定[J].中国酿造,2015(10). 
  [3]李爱芬,孙祖莉,陈敏,等.海产品中蛋白酶产生菌的选育及产酶条件研究[J].海洋科学,2003,27(9):41-43. 
  [4]荆谷,冯静,孔健,等.微生物金属蛋白酶研究进展[J].生物工程进展,2002,22(1):61-63. 
  [5]王吉庄,钟芳,王璋.高水解度大豆肽的制备[J].食品工业科技,2003,24(9):40-42. 
  [6]陈宏军.蛋白酶高产菌株的紫外诱变选育[J].安徽农业科学,2010,38(3):1110-1111,1130.


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